caractérisation de nouvelles signalisations neuro-développementales impliquées dans la biologie du neuroblastome

le neuroblastome (nb) est un cancer pédiatrique dont les tumeurs sont localisées dans les tissus dérivés des cellules des crêtes neurales (ccn) : les ganglions sympathiques et la glande médullo-surrénale. des sites métastatiques sont retrouvés chez un enfant sur deux au diagnostic et constituent un facteur de mauvais pronostic. l'étiologie de ce cancer est encore mal comprise, néanmoins, il est maintenant communément admis que les tumeurs proviennent du lignage sympathoadrénal de la crête neurale. les ccn sont des cellules pluripotentes qui vont naviguer à travers l'embryon pour former notamment les drg (ganglions dorso-rachidiens) et la chaîne des ganglions sympathiques (sg). ce système finement régulé peut néanmoins être perturbé et générer des nb. les modèles in vivo utilisés couramment pour l'étude du nb sont les xénogreffes chez la souris nude, ainsi que des modèles murins de mutations. ces modèles ne sont pas représentatifs des différents types de nb et ne permettent ni de reconstituer ni d'influer sur l'environnement embryonnaire des tumeurs en formation. nous avons mis au point un modèle de xénogreffe de cellules issues de nb au niveau de la crête neurale d'embryons de poulets. la totalité des cellules quittent le site de greffe pour coloniser les dérivés sympathiques à l'image des ccn endogènes, puis forment des tumeurs au niveau des sg et de la glande médullo-surrénale. ce modèle mime donc la dissémination des cellules tumorales au sein du microenvironnement embryonnaire et vers les sites de développement tumoraux de la pathologie pédiatrique. l'accessibilité du modèle aux manipulations expérimentales en fait un outil unique et original pour aborder la question des interactions entre microenvironnement embryonnaire et tumorigenèse neuroblastique. le partenaire 1 a une solide expérience dans la recherche en cancérologie et plus particulièrement sur le nb (bouzas-rodriguez et al, 2010, jci, gennevois et al, 2013, pnas, ichim et al, 2013, mol cell), en collaboration notamment avec le partenaire 3, oncologue pédiatre dans un centre de référence pour le traitement du nb (centre léon bérard, lyon) (marabelle et al, 2011, pediatr blood cancer - marabelle et al, 2013, jci). le partenaire 2 est expert du modèle de l'embryon de poulet et, plus fondamentalement, des mécanismes qui contrôlent le développement de structures nerveuses y compris celles qui dérivent des ccn (nawabi et al, 2010, genes and dev - charoy et al, 2012, neuron, sanyas et al, 2012, development). nos objectifs pour ce projet sont : (i) l'étude de la dissémination des cellules issues de nb dans notre nouveau modèle aviaire afin de mieux comprendre l'étiologie du nb et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques (ii) l'étude de voies de signalisation contrôlant la migration des ccn et leurs éventuelles altérations dans les cellules de nb. axe i : etude du comportement de cellules neuroblastiques dans un nouvel animal modèle. notre objectif est, d'une part, de cartographier le trajet de migration et l'invasion métastatique de plusieurs lignées de nb exprimant différentes protéines fluorescentes ainsi que des tumeurs fraîches. d'autre part, nous allons comparer le transcriptome de cellules de nb avant la greffe et après leur dissémination par microdissection des masses tumorales et analyse transcriptomique. axe ii : etude du rôle de la voie trkc, nt-3 dans la biologie des cnn et du nb. une des molécules clés dans le guidage des cnn au cours du développement est la neurotrophine-3 (nt-3). nous avons montré que trkc induit l'apoptose en absence de son ligand nt-3. cette activité proapoptotique lui confère un rôle de suppresseur de tumeur dans le nb (bouzas-rodriguez, 2010, jci). nous cherchons à déterminer si cette fonction proapoptotique permet de réguler le nombre adéquat de précurseurs neuronaux dans des structures dérivées des cnn : les drgs et les sgs. en parallèle, nous allons utiliser un anticorps capable d'induire la fonction proapoptotique de trkc dans les nb et déterminer s'il pourrait permettre d'altérer la dissémination des cellules tumorales dans notre modèle aviaire, dans une perspective thérapeutique. axe iii : etude du rôle de la signalisation semaphorin dans la biologie de cnn et des nb. la voie de signalisation semaphorin3c, neuropilin, plexin est également essentielle pour la migration des cnn et la formation de leurs dérivés. néanmoins, son rôle n'a pas été investigué dans les nb alors que sema3c est suprexprimé dans les lignées de nb. notre objectif est de déterminer comment sema3c contribue à la tumorigenèse du nb in vitro puis dans le modèle aviaire. axe iv : exploiter le modèle aviaire pour cribler des thérapies en développement préclinique pour le nb. le partenaire 3, pédiatre oncologue, est responsable du développement préclinique de thérapies ciblant les nb au centre léon bérard. notre modèle aviaire constitue un modèle idéal pour cribler en 72h un grand nombre d'agents thérapeutiques et évaluer leur efficacité.

neuroblastoma (nb) is a childhood cancer in which tumors are mainly localised in tissues derived from the neural crest cells (ncc): sympathetic ganglia (sg) and the adrenal gland. one child out of two has metastasis at diagnosis, a feature associated to bad prognosis. the etiology of this cancer remains poorly understood, nevertheless, it is now widely accepted that the cells of origin for nb arise from the sympathoadrenal lineage of the ncc during development. ncc are pluripotent cells, they delaminate from the dorsal part of the neural tube, navigate through the embryo to form in particular the drg (dorsal root ganglia) and the sympathetic ganglia (sg). this fine-tuned system can however get deregulated and generate nb. nb tumorigenesis is, as other cancers, classically studied using subcutaneous xenografts in nude or transgenic mice. these models are not representative of the various types of nb, and do not allow to reconstitute or to modify the embryonic environment of the forming tumors. we have set up a model of xenograft in which nb cells are inoculated in the neural crest of chick embryos. all the cells leave the graft site, migrate ventrally and colonize the sympathetic derivatives as the endogenous ncc do. they later form tumors in the sg and the adrenal gland. this model hence mimics the dissemination of tumoral cells in an embryonic microenvironment and toward the sites where tumors occur in the human pathology. this model allows technical ingineering and constitutes a unique and original tool to investigate the interactions between embryonic microenvironment and nb tumorigenesis. partner 1 has a long-lasting experience in cancer research and has been investigating nb (bouzas-rodriguez et al, 2010, jci, gennevois et al, 2013, pnas, ichim et al, 2013, mol cell) in collaboration with partner 3, pediatric oncologist in a nb reference cancer center (centre léon bérard, lyon) (marabelle et al, 2011, pediatr blood cancer. marabelle et al, 2013, jci). partner 2 is expert in the engineering of the chick embryo model and more fundamentally in the mechanisms controlling the development of neuronal structures including those derived from ncc (nawabi et al, 2010, genes and dev- charoy et al, 2012, neuron- sanyas et al, 2012, development). our main objectives are (i) the study of nb cells dissemination in our new avian model in order to improve our knowledge on nb etiology and identify new therapeutic targets- (ii) to investigate molecular pathways controlling the development of ncc sympathoadrenal lineage and examine their potential alterations in nb cells. aim i: studying nb cells behavior in a novel animal model. our objective is, on one hand, to cartography the migration and the metastatic invasion of several nb grafted cell lines, expressing various fluorescent proteins and fresh tumors. on the other hand, we will compare the transcriptome of nb cells before grafting and after dissemination by microdissection of the tumoral mass followed by rnaseq analysis. aim ii: investigating the nt-3, trkc pathway in the biology of ncc and nb. one of the key guidance, proliferation and diffenciation cue for ncc is neurotrophine-3 (nt-3). we have shown that its receptor trkc triggers apoptosis in absence of its ligand. this apoptotic activity confers to trkc a tumor suppressor activity in nb (bouzas-rodriguez, 2010, jci). we will determine whether this apoptotic function regulates the adequate number of neuronal precursors in structures derived from the ncc: the drg and sg. in parallel, we will use an antibody able to trigger trkc apoptotic function in nb and determine whether it could be used, in a therapeutic perspective, to affect the dissemination of tumoral cells in our avian model. aim iii: investigating the semaphorin signaling in the biology of sympathoadrenal ncc and nb. the semaphorin3c, neuropilin, plexin pathway is also key in the migration of ncc and the development of their derivatives. nevertheless, its role has never been investigated in nb despite the fact that sema3c is overexpressed in nb cell lines. or objective is to determine if and how sema3c contributes to the tumorigenesis of nb in vitro and in our avian model. aim iv : exploiting the avian model to further assess the mode of action of current nb therapies. partner 3, pediatric oncologist is responsible for the preclinical development of therapies targeting nb in the léon bérard cancer center. our avian model constitutes an ideal model to screen in 72h a large panel of therapeutic agents and evaluate their efficiency. in conclusion, this project should enhance our basic knowledge on nb, taking advantage of an innovative animal model that allows the study of the oncogenic transformation of ncc in nb tumoral cells. this project should finally favor the preclinical development of therapies.